蛋白质浓度测定之双缩脲法

蛋白质浓度测定之双缩脲法

本文介绍蛋白质浓度测定常见的另外一种方法,双缩脲法,也称Biuret法。

双缩脲生成反应式

一、实验原理

双缩脲,也称氨缩脲、缩二脲等,它是两个分子脲(即尿酸)在180℃左右加热条件下脱出一个氨后缩合形成的一种有机物,分子内含有两个领接的肽键,其在碱性溶液中可与Cu2+发生络合反应生成紫红色络合物,这种反应称为双缩脲反应。

蛋白质分子中含有大量彼此相连的肽键,同样可以在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应生成紫红色络合物,溶液颜色的深浅与蛋白质浓度相关,与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,且溶液在540nm处的吸光度值与蛋白质含量在一定范围内具有良好的线性关系,因此可以利用此法测定蛋白质浓度。

二、试剂与器材

1、试剂:

1)标准蛋白溶液:可用牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白,并用蒸馏水准确配制成10 mg/mL 浓度的标准溶液。

2)双缩脲试剂:称以1.50 g硫酸铜(CuSO4-5H2O)和6.0 g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6-4H2O),用500 mL蒸馏水溶解,在搅拌下加入300 mL10% NaOH溶液,使得溶液呈碱性,之后再用水稀释到1升,并贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。可长期保存,但若干瓶中出现黑色沉淀则需要重新配制。

3)待测蛋白溶液:应适当进行稀释,使得浓度在标准曲线范围内。

2、器材:

分光光度计、恒温水浴、移液器、涡旋混匀器、试管若干等。

三、操作方法

(1)移液。选取7支洁净试管,其中5支标号1-5号管,其他2支分别标签空白管和待测管。按照下表用移液器准确移取相应的标准蛋白溶液或待测样品、蒸馏水和双缩脲试剂于试管中。

(2)保温。将上述各试管混匀后置于恒温水浴锅中37℃加热20分钟;

(3)测量吸光度。吸取各试管中的溶液于比色皿中并用分光光度计的540nm波长测定各吸光度值A540;

(4)制作标准曲线。以标准蛋白质浓度为横坐标,吸光度值A540为纵坐标绘制标准曲线;

(5)计算。将测得的待测蛋白吸光度值代入标准曲线,就可计算得出蛋白质浓度。

四、方法优缺点

优点:

1、不同蛋白质产生颜色深浅相近,干扰物少;

2、测定时间较短(20-30分钟),方法较为简便快速

3、适用于需要快速但不需要很精确测定的蛋白质测定

缺点:

1、灵敏度较低,测定范围为1-20mg蛋白质

2、干扰物质主要是硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等

点成生物可提供多款高性能的恒温水浴、移液器、涡旋混匀器等,满足不同实验需要。

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