在生命科学研究领域，外周血单核细胞（PBMC）研究是许多重大科研项目的关键环节，无论是感染性疾病、自身免疫疾病，还是肿瘤免疫学的研究，PBMC 都扮演着不可或缺的角色。然而，PBMC 的精确计数一直是个让人头疼的难题。
PBMC 体积小巧，细胞边缘模糊不清，这使得检测时难以精准识别；而且在样本分离过程中，大量细胞碎片和潜在的红细胞污染问题频发，这些干扰因素严重影响自动对焦性能，进而导致细胞计数和活力测定出现误差，让科研结果的准确性大打折扣。
为了突破这一困境，科研设备不断升级革新。基于荧光检测的细胞计数仪，如 点成LUNA-FX7™自动细胞计数仪，成为了提高 PBMC 计数准确性的常用选择。但对于追求高性价比，希望仅依靠明场光学系统实现精准计数的科研工作者而言，挑战依然存在。
点成LUNA-III™自动细胞计数仪应运而生，它创新性地融合了焦平面偏移校正技术和优化的细胞检测算法，并配合台盼蓝染色，为 PBMC 计数难题提供了新的解决方案。那么，它在实际应用中的表现究竟如何呢？接下来，我们将通过对比 LUNA-III™和 LUNA-FX7™自动细胞计数仪在 PBMC 计数和活力测定中的表现，一探究竟。
1 实验材料与方法
首先采集人外周血，运用标准密度梯度离心法，借助 Histopaque – 1083（Sigma，#10831）成功分离出 PBMC 样本。完成分离后，将富含血沉棕黄层的 PBMC 重悬于含 1% BSA 的 PBS 溶液中备用。
在系列稀释测定环节，把 PBMC 按照 1 至 32 倍的不同稀释因子进行梯度稀释。同时，精心制备了一批用于活力测定的 PBMC 样本，并分别设定理论细胞活力水平为 0%、25%、50%、75% 和 100% 。
计数和活力测定实验使用点成LUNA-III™自动细胞计数仪，搭配LUNA™细胞计数专用载片，并启用内置的 PBMC 计数程序（具体参数设置详见表 1）。在样本上机前，将细胞样本与 0.4% 台盼蓝溶液（货号 T13001）按照 1:1 的体积比充分混合。为了对比分析，同一批样本也会用点成LUNA-FX7™自动细胞计数仪进行测试。
2 不同偏移水平下的检测结果对比
#细胞浓度检测结果 #
使用 点成LUNA-III™和 点成LUNA-FX7™在三个不同的偏移水平（0、1 和 2）下对 PBMC 样本进行测试，以此验证在不同浓度和活力水平下的线性关系。
实验数据显示，所有偏移水平下，点成LUNA-III™测得的细胞浓度与理论细胞浓度均表现出较强的相关性，R² 值均在 0.9921 以上（见图 1A）。这表明点成 LUNA-III™在细胞浓度检测方面具有较高的可靠性。进一步分析发现，偏移水平 2 的测量结果与点成 LUNA-FX7™的数据最为接近。而且，从图 1B 中可以直观看到，点成LUNA-III™能够精准识别并标记 PBMC，随着稀释倍数从 1 到 32 变化，检测到的细胞数量也呈现出相应的变化趋势。
图 1. (A) 在不同稀释梯度的 PBMC 样本中，点成LUNA-III™ 细胞计数与理论细胞浓度之间的线性关系。(B) 使用点成 LUNA-III™ BF-total 模式检测不同稀释水平的代表性图像。橙色圆圈标记点成 LUNA-III™ 识别出的细胞，检测到的细胞数量从左至右逐渐增加，对应的稀释倍数范围为 1 至 32。BF-total：测量细胞总数的明场细胞计数模式。
#细胞活力检测结果 #
在细胞活力测定实验中，同样在三个偏移水平（0、1 和 2）下进行测试，并与点成 LUNA-FX7™的活力数据进行对比分析。结果显示，偏移水平 1 和 2 与理论活力值相关性较强（R² = 0.9906 和 0.9987），但只有偏移水平 2 的结果与点成 LUNA-FX7™数据高度一致（见图 2A）。偏移水平 0 与理论活力值的相关性较低（R² = 0.9579），且测量结果与点成 LUNA-FX7™存在较大偏差。从图 2B 的细胞活力标记示例图中可以清晰看到，在点成 LUNA-III™系统中，偏移水平 2 对不同活力水平的活细胞与死细胞标记最为准确。
图2. (A) 比较点成 LUNA-III™ 在三个偏移水平(0､1 和 2)下测得的细胞活力与点成 LUNA-FX7™ 的测量结果｡ (B)点成 LUNA-III™ 在偏移水平 0､1 和 2 下的细胞活力标记示例图｡红色圆圈表示死亡细胞,绿色圆圈表示存活细胞｡ *点成LUNA-FX7™ BF-Viability:点成LUNA-FX7™ 使用明场成像评估细胞活力的计数模式｡
3 台盼蓝染色法在 PBMC 计数中的局限性
尽管点成 LUNA-III™在 PBMC 计数和活力评估方面表现出色，但台盼蓝染色法本身存在显著局限性。台盼蓝染色法无法有效区分 PBMC 与污染物，如红细胞和细胞碎片。这就可能导致总细胞计数出现过高估算的情况，同时细胞活性评估也会不准确，因为污染物很可能被误计为死亡细胞。
相比之下，像点成 LUNA-FX7™等基于荧光的细胞计数仪所采用的荧光染色方法，能够选择性地识别活细胞和死亡细胞，还能有效排除污染物干扰，从而提供更为精准的评估结果。所以，当处理可能含有红细胞或碎片的 PBMC 样本，且对细胞活性和总细胞计数的准确度要求较高时，强烈建议使用荧光染色方法。
4 结论
点成LUNA-III™自动细胞计数仪凭借集成的焦平面偏移和先进的细胞检测算法，显著提升了 PBMC 计数和活性评估的准确性与精确度。尤其是偏移级别 2，其表现与高性能的点成 LUNA-FX7™相当，为科研工作者提供了一种经济高效的选择。
然而，我们必须认识到，使用台盼蓝染色法进行 PBMC 计数时，存在无法区分污染物的问题。科研人员在实际操作过程中，需要充分考虑这些局限性，根据实验需求谨慎选择合适的检测方法和设备。希望未来能有更多创新技术出现，进一步完善 PBMC 计数和活力评估的解决方案，推动生命科学研究不断向前发展。
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