1 引言
精子细胞评估（又称精液分析），在判断男性生育潜力方面发挥着重要作用。虽然它并非直接衡量生育能力的指标，但男性生育能力对人类生育和畜牧业育种均具有重要影响，因此精子细胞评估备受关注。
目前，可通过流式细胞术和基于图像的分析工具进行精子细胞评估。点成LUNA-FX7™自动细胞计数仪等自动化设备可利用图像快速、便捷地分析精子样本。然而，由于精子细胞相较于哺乳动物细胞在形态和特性上的独特性，因此需要优化分析参数并选择合适的染料。
本研究对SYBR14、吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）等荧光染料进行了比较分析，以优化点成LUNA-FX7™对精子细胞的评估能力。本研究旨在评估不同染料组合的有效性，并优化精子细胞评估的参数设置。
2 材料与方法
#样本制备 #
解冻牛的冷冻精液样本，并用PBS替换缓冲液。根据样本情况，将精液样本以约1:20至1:40的比例稀释于PBS中。
#荧光染色 #
1.混合：
18 μL PBS中的精子细胞
2 μL混合的绿色和红色荧光染料
2.在37℃孵育10分钟
3.将样本加载至合适的载玻片
4.使用点成LUNA-FX7™进行分析
3 优化精子细胞评估的细胞计数方案和染料组合
总结：SYBR14/PI 与 AO/PI 双重染色均适用于精子活力评估，但 SYBR14/PI 表现更优。
点成LUNA-FX7™的默认协议已针对常见哺乳动物细胞优化，但精子细胞评估需要调整曝光水平、细胞尺寸和去团聚灵敏度等参数。例如，将最小搜索尺寸从3 µm调整为7 µm，并将去团聚灵敏度从5调整为7，以提高检测性能（表1）。此外，SYBR14/PI和AO/PI染色的曝光水平分别设定为GF 6和RF 9。
在此基础上，我们对SYBR14/PI和AO/PI染色方法进行了比较分析。鉴于SYBR14/PI染色法在精子细胞评估中的已知有效性，我们关注AO/PI染色法的表现。研究结果表明，两种染色方法均可用于精子细胞评估（图1）。然而，SYBR14在精子细胞染色中的适用性优于AO，表明SYBR14的化学特性可能更适合这一应用。
图1. 用两种不同染料（SYBR14/PI和AO/PI）染色的精子细胞的荧光图像。该组合图像展示了分析后的明场、绿光、红光和标记图像。标记图像为复合荧光通道图像，其中红色圆圈表示死亡细胞，绿色圆圈表示存活细胞
结论
本研究发现，SYBR14/PI和AO/PI染色法均可用于评估精子细胞存活率，但SYBR14/PI的表现更优。此外，曝光水平及其他参数的调整对整体检测性能至关重要。尽管点成LUNA-FX7™并非专门针对精子样本优化，但通过推荐的样本稀释比例和成像条件优化，它仍可提供快速、便捷的精子细胞评估方案。
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