细胞培养三步骤——复苏、传代、冻存

细胞培养三步骤——复苏、传代、冻存

细胞培养是指在体外模拟生物体内环境(无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等),使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术,是细胞生物学研究方法中重要和常用技术,通过细胞培养既可以获得大量细胞,又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。

细胞培养的具体步骤可分为:细胞复苏、细胞传代、细胞冻存

一、细胞复苏

  1. 细胞复苏的原则:快速融化

在复苏细胞时必须遵循快速融化的原则,即必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至 37 ℃,因为这样可使冻存时细胞外的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。

  1. 细胞复苏操作过程

二、细胞传代

  1. 细胞传代中遇到的问题及解决方案:
  • 传代密度过高:一旦细胞养太久至融合度过高(>90%)才传代,容易使细胞产生老化现象,甚至是堆叠,再消化细胞时不易吹打成单颗细胞,即便再重新铺盘传代,细胞也无法回到原本的特性了。(如:单层细胞,没长满就发生堆叠现象)

解决方案:尽量避免融合度过高,镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。

  • 传代密度低:哺乳动物贴壁培养细胞,若细胞培养到80-90%密度需要开始传代,在传代接种细胞密度过低,细胞间距离太远,就无法在细胞间产生黏附及通信作用,帮助信号传导并活化细胞;总体细胞量不足,分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境,以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。

解决方案:细胞传代时,要进行准确的细胞计数,确保铺盘的密度。

  1. 细胞传代操作过程:

三、细胞冻存

  1. 细胞冻存的基本原理:慢冻
  • 手动降温:将细胞依序放在4℃(30分钟)、-20℃(1小时)、-80℃(过夜)后移至液氮中保存。
  • 程序降温盒:是一般最广泛使用的降温法,为一种特制冷冻容器(填充异丙醇或依靠特制金属导热),使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃(过夜),然后移至液氮中保存。
  • 免液氮程序降温仪:一种新型自动化程序降温方法,通过微处理器精确控制冷却速率和样品温度,能够控制样品线性/非线性降温,能够有效减少冻融过程对于细胞或组织的伤害,重现性好,降温过程可控,成本低。(例如点成生物CRF-1免液氮程序降温仪)
  1. 细胞冻存操作过程:

点成生物产品推荐:CRF-1程序降温仪

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