酵母细胞计数与活力检测：LUNA-FL™ vs ASBC 标准方法全对比
LUNA-FL™ 荧光细胞计数仪配合 FDA/PI 双染，可在 30 秒内完成 0.5 µL 样本的酵母细胞总数与活力测定，计数体积是 ASBC 标准方法（0.1 µL）的 5 倍，且规避人工判读与主观误差。本文给出酵母细胞计数与活力检测的完整操作步骤、背景荧光干扰的两种解决方案，以及与 ASBC 法的逐项对比。
01
引言
酵母是生物研究与工业领域不可或缺的模式生物。作为最简单的单细胞真核生物，其基因组小、基因数量少且单细胞特性使其成为细胞生物学与遗传学研究的重要模型，尤其在细胞周期调控和信号传导领域。酵母能将碳水化合物转化为二氧化碳和酒精两种产物，前者被用于烘焙业，后者则用于啤酒、葡萄酒等酒精饮料酿造，已有数千年历史。近年来，酵母的产酒精能力被应用于以玉米和甘蔗为原料的生物乙醇生产。
但落到”数清楚有多少活酵母”这件事上，传统方法相当吃力：当前酵母计数的标准方法是美国酿造化学家协会（ASBC）法。该方案使用膜不通透染料亚甲基蓝对酵母染色：死酵母因膜完整性受损呈蓝色，活酵母则不被染色。
由于酵母细胞体积小，需使用高倍物镜（如40倍或更高）观察，而放大倍数与视野范围（FOV）成反比。研究人员需在血细胞计数板的小方格中逐一计数活细胞和死细胞，移动显微镜载物台至相邻方格重复计数，直至累计计数体积达0.1µl（相当于血细胞计数板中央大格的25个小方格）。此过程耗时长达30分钟且易产生误差（典型误差率达25%），这源于人工操作、主观判断及小计数体积（0.1µl）的局限性。对于啤酒酿造、葡萄酒酿造或生物乙醇生产等复杂培养体系，手动计数更为困难。研究人员需逐一区分酵母细胞与非细胞杂质（如啤酒中的酒花、葡萄酒中的葡萄残渣或生物乙醇中的玉米醪）。
相比之下，LUNA-FL™荧光细胞计数器仅需30秒即可完成0.5µl（ASBC方法的5倍体积）样本的酵母计数。由于采用更大计数体积（0.1µl的5倍）且完全避免人工误差和主观判断，该方法可获得更高的统计显著性。用户无需手动区分酵母细胞与非细胞杂质（如啤酒花、葡萄残渣或玉米醪等）。此外，若使用两种荧光染料且其激发/发射波长与LUNA-FL™荧光细胞计数器的光学系统匹配，还可通过多标准评估细胞活力。
荧光素二乙酸酯（FDA）是一种荧光细胞活性探针。其工作过程包括：
- 渗透：借其膜渗透特性，FDA可自由穿过从细菌到哺乳动物细胞等多种生物体的质膜。
- 水解：进入细胞内的FDA经胞内酯酶水解转化为荧光素，该物质最大激发波长494nm、发射波长521nm，与常规显微镜及全自动荧光细胞计数器LUNA-FL™的绿色通道滤光片组相匹配。
- 滞留：转化后的荧光素因3号碳位羧酸基团携带一个负电荷，无法再次穿透质膜，其滞留能力依赖于质膜的完整性。
因此，FDA染色法可同步检测酯酶代谢活性与质膜完整性，其工作原理如图1所示。
图1. 使用FDA进行酵母计数的工作原理
02
用 LUNA-FL™ 测酵母活力的完整操作步骤
- 材料
菌株 | 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） |
培养基 | 酵母培养基（YPD） |
仪器 | LUNA-FL™ 荧光细胞计数仪 |
耗材 | LUNA-FL™ 专用 PhotonSlide™ 载玻片 |
试剂盒 | 酵母活力检测试剂盒（含 FDA/PI 双染液、酵母稀释缓冲液、荧光信号增强剂 1 号 |
- 方法
- 在 YPD 酵母培养基中过夜培养酿酒酵母（ cerevisiae）
- （可选）将浓厚的酵母培养物按 1:100 稀释，并额外培养 3 小时，以获得对数中期细胞
- （可选）根据酵母细胞浓度，将过夜培养的酵母培养物按 1:100 稀释于酵母稀释缓冲液中。离心后弃去上清液，用酵母稀释缓冲液重新悬浮沉淀
- （可选）将酵母样本加热至 70℃，处理 30 分钟以制备 0% 活力的酵母细胞
- （可选）混合1 µl荧光信号增强剂1和17 µl的酵母样本
- （可选）室温孵育10分钟
- 向酵母样本中加入1 µl FDA 和1 µl PI
- 室温避光孵育10分钟
- 取10 µl染色后的酵母样本加至计数载玻片
- 静置约1分钟，直至所有酵母细胞停止移动
- 启动LUNA-FL™荧光细胞计数仪，选择”酵母细胞计数（FDA/PI）”程序
- 按以下方案进行细胞计数
03
结果和讨论
如图2A所示，当检测100%活性的酵母样本时，FDA（荧光素二乙酸酯）能成功标记所有酵母细胞。明场图像中可见的酵母细胞均被计数，并以绿色圆圈标注（绿/红圆圈分别代表LUNA-FL™自动判读的活/死细胞）。为验证FDA/PI染色区分活/死细胞的能力，我们通过70℃加热30分钟制备0%活性样本（强制灭活），并按1:1比例混合100%与0%活性样本制备50%活性样本。图2B和2C显示，即使活/死酵母混合于同一体系，FDA/PI染色仍能有效区分，所有细胞均根据存活状态被计数并标记相应颜色圆圈。随后采用0%、25%、50%、75%和100%活性梯度样本评估LUNA-FL™的检测精度。如图2D所示，仪器实测活性值与理论值高度吻合（相关系数R²=0.9991）。综上表明，FDA/PI染色结合LUNA-FL™荧光计数可实现酵母细胞的精确活/死判别。
与AO/PI染色不同，FDA染色依赖酶促反应产生荧光，因此需要一定时间积累可检测信号。为确定最佳检测时间，我们在100%活酵母中添加FDA后，分别于0、5、10、15、20和30分钟测定细胞平均荧光强度。图3A显示：未孵育时FDA荧光与背景值相当（约40）；前5分钟荧光信号快速上升，随后5分钟增速显著减缓，10分钟后进入平台期。因此确定10分钟为最佳孵育时间。
LUNA-FL™ 自动酵母细胞计数结果图
FDA 标记酵母细胞的动力学曲线（0–30 分钟平均荧光强度变化）
如图4A所示，尽管FDA本身无荧光，但某些细胞培养基存在自发荧光现象。这种背景荧光会掩盖部分酵母细胞的微弱信号。此外，新鲜配制的YPD培养基残留有酯酶活性（图4A/4B）。若FDA被胞外酯酶水解为荧光素，该分子将无法进入酵母细胞，导致背景荧光增强而目标细胞荧光信号同步减弱。值得注意的是，酯酶活性引发的背景荧光强度远超YPD培养基的自发荧光。这两类干扰信号很可能源自YPD组分（特别是酵母提取物和蛋白胨）的特性。
研究发现，与新鲜YPD培养基相比，过夜培养酵母的YPD培养基酯酶活性显著降低。推测酵母在增殖过程中吸收了培养基中具有酯酶活性的蛋白质组分，并将其转化为自身构建原料。综上表明，部分培养基确实存在自发荧光及残留酯酶活性。针对此情况，建议采取以下任一方案：1）用适当缓冲液（如酵母稀释缓冲液）稀释培养基（图4C）；2）若背景荧光仍过强，可离心处理酵母培养物，弃去上清液后将沉淀重悬于酵母稀释缓冲液中。
图4. YPD培养基的自发荧光特性及酯酶活性检测
根据酵母菌株及培养条件的不同，即使经酯酶激活的荧光素分子也可能发生渗漏。如图5A所示，这种渗漏现象会导致背景信号升高，同时减弱酵母细胞的荧光强度。Logos biosystems公司开发的专利试剂——荧光信号增强剂1——能有效阻止活化荧光素从酵母细胞外泄。图5B显示，由于该增强剂阻断了荧光素外排，培养体系背景显著变暗，而单个酵母细胞的荧光信号则明显增强。
图5. 荧光信号增强剂1的双重作用：降低背景荧光水平并提升酵母细胞荧光强度
04
结论
LUNA-FL™荧光细胞计数仪与FDA/PI染色剂、酵母稀释缓冲液及荧光信号增强剂1联用时，可在30秒内以极高的准确度和精密度完成酵母细胞总数统计及活性检测。得益于该设备既能检测纯培养物也能分析复杂培养体系的特点，学术界、生物技术/大型制药企业及酒精工业等众多领域均可从中获益。
附：关于点成生物与Aligned Genetics（原Logos Biosystems)
LUNA-FX7™ 是Aligned Genetics（原Logos Biosystems) 的全自动细胞计数仪产品，由点成生物提供中国市场的技术支持、应用验证与售后服务。点成生物应用技术团队在细胞分析方向的能力覆盖：
- 方法开发：明场（台盼蓝）与荧光（AO/PI）双计数模式的参数优化与协议定制
- 选型支持：按样本通量、浓度区间与耗材预算推荐载玻片与机型组合
- 培训与售后：装机培训、方法迁移（从血细胞计数板到自动计数）、定期校准
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