在单细胞基因组学研究中，准确评估细胞核质量至关重要。将荧光染料与自动细胞计数仪等成像工具结合使用，是评估细胞核质量的有效方法。在众多荧光染料中，选择最佳组合以评估核质量对于确保结果的可靠性至关重要。
此外，随着现代自动细胞计数仪（如点成LUNA-FX7™和点成LUNA-FL™）功能日益强大，深入了解这些系统在不同荧光染料组合下的表现显得尤为必要。本研究旨在通过分析不同细胞类型、不同系统以及核固定条件下的荧光染料组合，找出最有效的评估核质量的方法。我们希望通过全面的分析，为单细胞基因组学研究中的核质量评估程序提供优化指导并提高评估的准确性。
1. 材料与方法
本研究使用了四种不同的荧光染料，且每种染料的最终浓度均有所不同：28 µM的嘧啶橙（AO），12.5 µM的钙黄素（AM），15 µM的碘化丙啶（PI），以及20 µM的EthD-1。这些染料组合成AO/PI、AO/EthD-1、Calcein AM/PI和Calcein AM/EthD-1四种染料。每种组合取各染料1µL，总体积为2µL，随后与18 µL细胞样本混合。
2. 核质量评估的最佳荧光染料组合
实验旨在找出最佳的染料组合，使用不同荧光染料评估U937细胞核和3T3细胞核的质量。理论上，完整的细胞应仅被膜透性染料（如AO和Calcein AM）选择性染色。而去除膜后的分离细胞核则应被非膜透性染料（如PI和EthD-1）染色，显示出与死亡细胞类似的活性状态。
在AO/PI、AO/EthD-1、Calcein AM/PI和Calcein AM/EthD-1这四种染料组合中，AO与PI或AO与EthD-1的组合能够准确显示完整细胞和分离细胞核的活性（图1A）。绿色和红色信号的存在，使其能够有效检测U937细胞和3T3细胞的活性。然而，在3T3细胞中几乎没有检测到Calcein AM信号，而在U937细胞中约有三分之二的细胞显示出Calcein AM信号（图1B）。这种差异可以归因于Calcein AM对酯酶活性的依赖性，而酯酶活性可能因不同细胞类型而异。因此，使用Calcein AM会遗漏部分完整细胞，从而降低活性评估的可靠性。
3. 定量核质量评估
点成LUNA-FX7™ 和 点成LUNA-FL™系统是功能强大的分析平台，能够无缝捕获明场图像和荧光图像，并通过荧光信号分析获得细胞大小、活性和数量等宝贵数据。
评估分离核质量时，可利用这些系统提供的平均细胞大小数据。例如，去除膜后的细胞核尺寸显著小于完整细胞，这是因为去除细胞膜和细胞质会使细胞大小减少数微米。特别的是，点成LUNA-FL™和点成LUNA-FX7™能够从明场图像中提取细胞大小信息，因此能最大程度地避免因荧光强度可能引起的细胞大小测量偏差。这确保了在评估分离核质量时，细胞大小测量的可靠性更高。
采用荧光染料检测细胞活性是核质量评估的另一个有用数据。如图1所示，当使用AO/PI或AO/EthD-1组合时，健康的完整细胞显示接近100%的活性，而分离核显示接近0%的活性值。像点成LUNA-FL™和点成LUNA-FX7™这样的自动细胞计数仪能够在这些染料的作用下，准确量化分离核的浓度（图2）。这些结果提供了重要数据，验证了核质量，为后续应用奠定了基础。
4. PFA固定后的核染色
核固定是长期保存的常见操作，因为它有助于保存细胞结构并便于后续分析。因此，为验证上述核质量评估方法是否适用于固定的核，我们使用AO/PI和AO/EthD-1对PFA固定的核进行测试。使用AO/PI染料组合时，无论固定状态或染料培养时间如何，均可观察到明显且强烈的PI荧光信号，这表明AO/PI染料可用于新鲜的分离核和固定核分析。然而使用AO/EthD-1时，固定核的EthD-1红色荧光信号减少，即使延长染料培养时间，荧光信号也没有增加。为解决这一问题，我们调整了自动细胞计数仪的曝光值，将其从默认的5增加到8。这一调整产生了更强的红色信号，与AO/PI组合的效果相当。这些结果表明，使用AO/EthD-1染料时，固定核的荧光信号会有所减弱，因此可能需要调整自动细胞计数仪的参数。
结论
在快速发展的单细胞基因组学研究领域，精确评估核质量是实现可靠研究结果的基石。研究评估的染料组合中，AO/PI和AO/EthD-1在区分完整细胞与分离核的活性差异方面表现最为出色。值得注意的是，AO/PI对新鲜核和固定核均表现出良好的效果，而AO/EthD-1在固定核的应用中需要优化。本研究通过结合适当的染料组合与先进的点成LUNA-FX7™和点成LUNA-FL™系统，提出了一种高效且可靠的分离核质量评估方法。这一成熟的方法为核质量评估提供了宝贵的技术手段，从而推动了单细胞基因组学研究的进步。
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